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在联合验证中,安评中心的行业竞争力日臻完善

作者:周长慧 邱云良   单位:安评中心   时间:2015-11-24

目前国内,在各项国际认证方面,有过硬资质的临床前安全评价机构,真的是不算多。而具备这样的竞争优势的安评中心,在张江开发区已经日臻完善地建立起国内一系列新药临床前安全评价模型。迄今为止,安评中心已为国内外140余家新药研发机构提供了2700多项安全性评价试验服务,其中包括美国、瑞士、日本、法国、丹麦、韩国等国家的16家国际制药公司委托的毒理试验。完成生物药评价82个,化药评价472个,中药17个,以及多个先导化合物的早期毒性筛选研究。中心出具的研究报告被欧盟成员国、美国、澳大利亚、印度和韩国等国普遍接受。

安评中心是我国最早的5个国家级GLP中心之一。成立之初,该中心就在基础薄弱、人才短缺、技术手段有限的条件下,不断创新思路,研究适应自身发展的路径,一点一滴地从研究方法、人员队伍、仪器设备等方面下功夫,反复验证拓展方向,以确保研究数据的可靠性、真实性、可重复性,保证人用新药的安全性,最终,在临床前安全评价领域里取得骄人的社会效益和经济效益。

安评中心建立了系统性的心脏毒性早期筛选和评价体系;建立了多个高通量药物遗传毒性筛选方法;建立了Pig-a基因突变试验,并参与了国际联合验证;建立了基于流式细胞术的体内和体外微核检测试验,并牵头了全国多家实验室的体内流式微核联合验证;建立并验证了多个肝、肾、心脏毒性研究的新生物标志物等。

“GLP的基本精神是真实。”安评中心主任马璟在提到临床前安全评价的研究理念时,着重强调:“我们以做好药物评价,提供真实可靠的科学数据为主要目的。评价模型必须采用国际公认、经过验证的稳定、可靠、可重复的方法。”

  “科研是为评价服务的。只有能真正帮上药企,我们的服务范围才会越来越广。”针对不断提高服务质量的工作,马璟说,“我们的企业始终瞄准行业的前沿动态,通过持续的资质提升,使自己真正成为这个行业中最值得信赖的服务提供者。”安评中心所建立的这一独特优质的服务平台有效助推了地区间的研发创新链。

Pig-a基因突变试验有望成为毒理学评价方法之一

遗传毒性评估是化学品和药品安全性评价的重要组成部分。现有致突变试验较多,但由于体外哺乳动物细胞致突变试验的特异度较低,与体内遗传毒性试验和致癌试验结果的一致性有所争议,仍不能完全满足管理毒理学安全性评价和风险评估的要求。近几年来,一项新的体内致突变试验,即基于流式细胞术的体内磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig-a)基因突变试验引起了学术界的关注。

该试验的基本原理和方法是动物单次或多次暴露于致突变物后,因造血系统细胞的Pig-a基因发生突变,致使细胞表型缺失,通过测定表型缺失细胞频率,即可对化学物的致突变性作定量分析。Pig-a基因突变试验可以弥补现有遗传毒性检测方法的某些不足,并相对节省人力、物力,效率提升明显。

基于流式细胞术的Pig-a基因突变试验引起国际遗传毒性工作组(IWGT)及美国健康与环境科学研究所(HESI)的重视。2008年启动了大鼠体内Pig-a基因突变试验的国际联合验证,同年美国健康与环境科学研究所属下的遗传毒理学技术工作小组成立Pig-a工作小组,致力于方法学的进一步优化和实验室间联合验证,并探讨将该试验法作为毒理学评价方法之一的可能性。

安评中心作为全球15家参与联合验证的实验室之一,采用此方法评价了N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、三聚氰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)和4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)四种不同遗传毒性作用机制化合物在SD大鼠体内微核试验和磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig-a)基因突变试验中的遗传毒性,并作为国际联合验证结果的一部分,在国际遗传毒性工作组对Pig-a试验的报告中作了总结。

2013年,国际遗传毒性工作组关于该试验的总结报告显示,已经完成40多个化合物的Pig-a基因突变试验,因此推崇重复给药方案,试验表明自发突变率极低。但是,大多数数据均来自于大鼠外周血红细胞,尚缺乏足够的证据表明Pig-a基因型突变与表型之间的关系。2015年,Mutagenesis杂志专刊刊发多个Pig-a试验,试图填补国际遗传毒性工作组和美国健康与环境科学研究所揭露的数据缺口。2015年5月,该试验方法已经被经合组织工作组批准,开始有关经合组织指导原则的起草筹备工作,预计2017年2月由经合组织提交国际联合验证资料,2018年初通过资料审查并起草OECD指导原则草案,有望在2020年完成经合组织指导原则的正式生效。

由于该方法是目前唯一的基于正常普通动物的体内基因突变试验,可以替代传统昂贵的转基因动物体内基因突变试验,应用于管理毒理学评价中。同时,流式细胞仪技术的应用也使得该方法与大鼠体内微核试验方法一起,整合于大鼠重复给药毒性试验中,大大减少了实验动物的使用量。由于Pig-a在哺乳动物中具有高度的保守性,这为在人体基础上开展PIG-A基因突变检查以及转化毒理学研究,提供了可行性。

 流式体内微核试验将大大提升安评服务力度

通过流式细胞仪的小鼠和大鼠体内微核试验,分别于2005年和2006年,完成了国际联合验证。2011年,人用药物注册技术要求国际协调会议(ICH)在所颁布的S2(R1)指导原则中接受该方法,此外,经合组织在2014年更新的指导原则(TG 474)中,明确了该方法的技术原则。

微核试验可用于动物骨髓细胞的遗传毒性检测。检测终点明确、结果重复性好且易于开展,是广泛应用的遗传毒理学检测方法。由于微核的产生是小概率事件,而常规的人工显微镜计数方法即耗时、费力,且受主观因素影响较大,越来越难以满足大量遗传毒性评价任务的要求。流式细胞术作为一种高通量的快速自动化方法成为微核研究的一个重要方向。

长期以来,国内相关研究机构开展此项试验,通常一直靠人工显微镜读片,效率低,对读片人员的经验要求很高。而安评中心借助“十一五”国家创制新药重大专项经费、利用实验室的仪器资源、来自试剂供应商的试剂支持,率先构建起一个行之有效的大小鼠体内微核自动化检测系统,并率先完成了实验室内的方法学验证。

2012年至2013年,安评中心牵头全国8家实验室,开展流式体内微核的联合验证。在中国食药监总局的指导下,国内共有8家GLP实验室参与该项目。安评中心利用自身的理念、人才、技术、设备和渠道优势,为这项联合项目创造了最佳的推进基础和环境。安评中心除顺利完成本实验室各阶段的验证试验外,还负责全国联合验证第I阶段的流式微核的操作培训,第II、III阶段其他各实验室的数据收集、技术指导和情况汇报。安评中心在对各阶段各实验室的结果进行初审以后,发给美国Litron实验室进行评估、解疑和最终评判。最终,安评中心以第一作者身份发表SCI论文,在Mutation Reserch杂志刊出,总结了全国联合验证的成果。该联合验证得到了中国食药监总局的大力支持和认可。这为该技术被中国管理机构接受、制定相关指导原则提供了技术基础和数据支持。可以说,本次联合验证的成果在中国GLP成长史上,具有开创性意义。

尽管中国食药监总局的药物遗传毒性指导原则尚未修订,但是,中国食药监总局作为国际协调会议的观察员,始终奉行其指导原则,接受经充分验证的流式微核试验资料。目前,安评中心已完成10余个新药的流式微核试验的IND资料,参与联合验证的其他实验室也正在积极开展实验室内的方法学验证,并加大开展这项技术对外服务的力度。

 

彗星试验列入遗传毒性标准组合试验的选项

2007年,日本替代方法验证中心(Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, 简写为JCVAM)联合日本、美国和欧洲的十四家实验室,应用40种受试物对体内彗星试验进行联合验证,国际联合验证的成果已成为经合组织的公共文件(No. 195和No. 196)。2011年,国际协调会议颁布ICH S2(R1)遗传毒性指导原则,推荐将碱性肝脏彗星试验列入遗传毒性标准组合试验的选项。2014年9月,经合组织通过了关于哺乳动物碱性彗星试验的指导原则(TG489)。

今年4月14日,由中国毒理学会遗传毒理专业委员会、中国毒理学会药物毒理及安全性评价专业委员会、中国药理学会药物毒理专业委员会、中国药学会药物安全评价专业委员会和上海市药理学会毒理专业委员会联合举办的大鼠体内彗星试验实验室间联合验证阶段I启动仪式及首次集中培训在上海举行。会议由国家上海新药安全评价研究中心(NCDSER)承办。本次国内联合验证在参考国际联合验证的基础上,增加了肾脏这个靶组织。中心副主任常艳博士分享了拟定的大鼠体内彗星试验联合验证II阶段方案。最终确认参加联合验证的实验室有12家。这成为一系列联合验证项目启动的先导,这其中包括Pig-a基因突变试验国际联合验证、流式体内微核国内联合验证和彗星试验国内联合验证。

目前,已经顺利完成I、II阶段的方案和SOP的优化。同年8月底,启动III阶段的联合验证。在下一步的验证中,将考虑采用不同机制的化合物(如肝、肾毒性非遗传毒性化合物或者肝、肾遗传毒性化合物),并可能与不同遗传毒性终点(如流式微核、Pig-a基因突变试验等)进行整合等。彗星试验可用于动物体内多种脏器遗传毒性的检测。

 

 

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