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生物仿制药的技术门槛有多高

作者:王守业   单位:   时间:2014-05-05

生物仿制药技术门槛高至少表现在两大方面。

首先是有关生产、制造过程和工艺流程。在产品生产过程中有多种因素可能会影响到生物仿制药的质量,如分子设计、表达系统、细胞株类型、翻译后修饰、不纯物和污染物、配方和辅料、包装容器、生产过程中的蛋白降解等。

其次是对生物仿制药在质量、安全性和有效性等方面进行分析检测、表征,需要在临床试验前在蛋白的多种性质上和原研药参考品一致。

生物仿制药的表征分析,涉及许多生物化学和生物物理技术,很难具体谈这些分析技术的细节和难度,只能试图通过简要评论这些相关技术手段来表述生物仿制药的门槛。

与化学药类似,对于生物药的评价,质量、安全性和有效性是最重要的三方面,而质量又是安全性和有效性的前提和基础。

对于生物药的质量方面,FDA认为治疗性蛋白的三大方面的性质(即PTM、蛋白高级结构和蛋白聚集)对于评价蛋白药是非常重要的。

蛋白的翻译后修饰

蛋白的翻译后修饰(PTM)有很多种,这些化学变化大多是在细胞内发生,但是有些也可能发生在生产的各个阶段,如纯化和储存过程。

现在的科学研究已经表明,蛋白的PTM会影响蛋白的活性和免疫原性。蛋白的PTM还可能会改变蛋白的结构进而引起聚集,从而进一步影响蛋白的免疫原性。因此,需要对蛋白类药物生产的各个阶段对蛋白质的PTM进行检测。

对于含有许多种蛋白质的复杂混合物(如有些预防性疫苗)的一类蛋白药物,即使是采用蛋白质组学技术,检测所有蛋白的PTM也是一个非常大的挑战。对于单一成分的纯化蛋白药,其PTM的检测和监测则相对容易一些。

研究蛋白PTM的最有力的利器当是生物质谱了。质谱在生物仿制药领域的应用近年来明显增多,但是由于生物质谱价格昂贵,动辄就是几十万美元,高端点的售价基本都在50万美元以上,这也限制了生物质谱在包括生物仿制药在内的生物制药领域的应用。

蛋白的高级结构

蛋白的高级结构是指蛋白的二级、三级和四级结构,这些结构特性决定了蛋白的三维空间结构,也进而最终决定了蛋白的功能和活性。因此,比较生物仿制药(指蛋白药)和原研药的蛋白的高级结构是证明两种药相似的重要手段。

X射线衍射和核磁共振(NMR)是公认的测定蛋白质三维空间结构的两种最主要的技术。但是,对于生物仿制药和原研药的结构相似性研究,这两种技术都有很大的挑战。对于X射线衍射而言,需要耗时较长的蛋白结晶过程和数据解析过程,对于样品量较大的工业界而言,这显然不能满足高通量的要求。而NMR不但价格昂贵、灵敏度相对较低、数据分析耗时长,对于分析分子量达150 kDa的大分子抗体药,也面临很大的挑战。

另外,还有一些其他经典的生物物理技术被用于表征蛋白的结构,如圆二色性谱、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、差示扫描量热法、分析超速离心、排阻色谱以及各种染料结合鉴别技术等。这些技术最主要的限制就是只能检测来自蛋白不同部位某一种总的信号。从这些测定得到的信息只能得到生物药整个结构的总的平均值。

比如对于圆二色性谱测定就只能表明某一种主要的二级结构(α螺旋、折叠和无规卷曲)的平均百分比。如果一个含有多个α螺旋结构的蛋白,其中只有一个α螺旋结构和另一蛋白相比发生了变化,但是即使这一变化相对较大,被另外不变的α螺旋平均以后,圆二色性谱所能测到的变化也可能很小,甚至没有可以测量出的变化。所以这些经典生物物理技术不能用于检测生物药很小的结构变化。

而更灵敏的技术则是氢氘交换质谱(HDX-MS),这也进一步显示质谱技术在比较生物仿制药和原研药结构方面的重要性。现代生物质谱技术在生物药领域的应用已经远不止做蛋白质鉴定、分子量测定、氨基酸序列测定,蛋白结构仅仅是其新的多种应用的一个方面。

蛋白聚集

蛋白聚集是蛋白药生产过程中很头疼的问题,尤其是对于高浓度的蛋白溶液,很容易引起蛋白聚集。单体蛋白的聚集过程可以是可逆的、也可能是不可逆的,其聚集后的大小可以从二聚体到包含有上万亿个蛋白单体的、肉眼就可看见的颗粒。

总的来说,蛋白聚集对于任何蛋白药都会是问题。蛋白聚集不但会降低蛋白药的有效剂量,更大的问题是可能会引起毒副作用和免疫反应,在有些特别情况下,这些难以预料的副作用甚至可能是致命的。正由于此,蛋白聚集必须被检测、定量和表征用以比较生物仿制药和原研药。

由于简单、易用、廉价、快速、样品用量少等特点,SEX-HPLC(排阻—高效液相色谱)是目前检测蛋白聚集的最常用方法。当然,SEX-HPLC也有自己的缺点,如较大的蛋白聚体可能在进样上柱时就被除去,造成假阴性。这也进一步说明没有任何一种十全十美的分析技术,正是缘于此,美国FDA建议生物仿制药研发企业不但检测蛋白不同种性质,也建议采用多种技术检测同一种性质,以尽量得到更全面的生物仿制药和原研药可以比较的多种信息(如理化性质、生物活性、免疫化学性质、纯度、不纯物和污染物等)。

值得一提的是,在生物仿制药领域有两个常用且易于混淆的概念:可比性和相似性。国际人用药注册技术协调会议(ICH)明确定义和限制可比性是指同一家生产商所生产的原研药(包括批准上市后阶段),在生产工艺变化(如放大)后,两种工艺所生产的同一产品(当然不可能100%相同)的可比性。而相似性则是生物仿制药生产商仿制的生物药与原研药生产商制造的参考品相比较而言的。

但事实上,可比性和相似性这两个概念在生物仿制药领域经常被不加区分地使用。对于生物仿制药研发企业而言,更大的挑战是如何充分利用这些技术证明其所仿制的生物药与原研药是相似的(或高度相似的)。

  

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